En 1515, la famille Holbein se fixa à Bâle, haut lieu de l'humanisme où Hans le Jeune se lia avec Erasme. De 1516 à 1526, travaillant pour la haute bourgeoisie commerçante, il réalisa des portraits, compositions religieuses, décorations murales, cartons de vitraux et des gravures et le musée d'art de la ville de Bâle possède ainsi la plus importante collection au monde d'œuvres de la famille Holbein. Influencé par Matthias Grünewald, son style s'ouvrit aux nouvelles conceptions de la Renaissance italienne.

En 1526, fuyant la Réforme, il partit pour Londres, recommandé par Erasme à Thomas More. Cette époque constitua l'apogée de sa carrière. Il exécuta le projet d'un arc de triomphe pour l'entrée d'Anne Boleyn à Londres et peignit Les Ambassadeurs en 1533. En 1536, nommé peintre-valet de chambre d'Henri VIII il devient en peu de temps le portraitiste officiel de la cour d'Angleterre. En 1543, en pleine gloire, il mourut de la peste.

Portraitiste recherchant derrière les apparences les expressions signifiantes des visages, il cherche à unir aux traditions gothiques les nouvelles tendances humanistes.